作者：王小欽
　　單位：復(fù)旦大學(xué)循證醫(yī)學(xué)中心 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院血液科
　　來源：協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志,2019,10(1）:76-79.

　　臨床病例資料數(shù)據(jù)龐大、資源豐富，如果臨床醫(yī)生合理利用其進(jìn)行臨床研究，則可節(jié)約大量時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，很快得出結(jié)論和成果。但已有臨床病例資料往往存在基線數(shù)據(jù)不全、不詳細(xì)，治療方案不統(tǒng)一，隨訪間期不等，失訪率高等問題，故需要良好的研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析來克服這些缺陷，才能得出可靠的結(jié)論。

　　臨床研究根據(jù)有無人為設(shè)計(jì)的干預(yù)因素分為試驗(yàn)性研究和觀察性研究，觀察性研究又根據(jù)有無對(duì)照組，分為描述性和分析性研究，隊(duì)列研究、病例-對(duì)照研究和橫斷面研究是常用的分析性研究設(shè)計(jì)方法［1］。除了不能進(jìn)行試驗(yàn)性研究和前瞻性隊(duì)列研究以外，現(xiàn)有臨床資料可進(jìn)行病例報(bào)道和病例分析，也可進(jìn)行病例-對(duì)照研究、回顧性隊(duì)列研究和橫斷面研究，故可設(shè)計(jì)的研究類型非常多。例如＜10例的罕見病可進(jìn)行病例報(bào)道，≥10例可進(jìn)行病例分析。

　　病因?qū)W研究多采用病例-對(duì)照方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，療效評(píng)價(jià)、預(yù)后研究和病因?qū)W研究可采用回顧性隊(duì)列研究設(shè)計(jì)，診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)可采用橫斷面研究方法。由于回顧性隊(duì)列研究應(yīng)用范圍最廣，故本文重點(diǎn)介紹如何利用臨床病例資料進(jìn)行回顧性隊(duì)列研究的設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析。

　　1 設(shè)計(jì)階段需注意的幾個(gè)問題

　　1.1 提出PICO問題

　　回顧性隊(duì)列研究的基本步驟包括：

　?。?）明確研究目的，確立結(jié)局指標(biāo)和研究因素，提出PICO（P：研究對(duì)象，I：干預(yù)或暴露因素，C：對(duì)照組，O：結(jié)局指標(biāo)）問題；
　?。?）確定研究對(duì)象的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)；
　?。?）計(jì)算樣本量；
　?。?）收集病例的基線資料；
　?。?）隨訪病例結(jié)局；
　　（6）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，校正各種混雜因素；
　　（7）總結(jié)、撰寫論文。

　　寫出PICO問題非常重要，其可幫助研究者理清思路和明確研究目的。例如，研究A基因突變是否是急性髓系白血病復(fù)發(fā)的高危因素，P（研究對(duì)象）是某種類型的急性髓系白血病，I（暴露因素）是有A基因突變，C（對(duì)照組）是無A基因突變，O（結(jié)局指標(biāo)）是白血病復(fù)發(fā)，在統(tǒng)計(jì)分析階段需要校正的因素有年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、原始細(xì)胞計(jì)數(shù)、染色體核型、化療方案等影響結(jié)局的因素。

　　1.2 基線數(shù)據(jù)缺失問題

　　針對(duì)基線資料不全的缺陷，在設(shè)計(jì)課題階段可采用限制方法，即設(shè)立納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，把關(guān)鍵資料缺失的病例排除。為了樣本有代表性，一般設(shè)立一個(gè)病例納入的年限，如納入2015年1月1日至2018年12月31日符合納入條件的所有病例（連續(xù)樣本），且排除標(biāo)準(zhǔn)不能太嚴(yán)格。如果排除的病例較多，最好進(jìn)行一個(gè)缺失數(shù)據(jù)模式分析，如為完全隨機(jī)缺失或隨機(jī)缺失，刪去缺失病例對(duì)結(jié)果的影響較小。也可比較納入對(duì)象和剔除對(duì)象的基線臨床特征，如無臨床特征顯著差異，則說明納入病例的代表性較好，基本可以代表總體病例。

　　1.3 計(jì)算樣本量

　　回顧性分析中只要有對(duì)照組，需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、計(jì)算P值的研究都需要計(jì)算樣本量，因?yàn)闃颖玖刻?，有可能得到假陰性的結(jié)果。樣本量的計(jì)算取決于主要結(jié)局指標(biāo)［2］，例如研究某一疾病的緩解率、無進(jìn)展生存率、總生存率的樣本量是完全不同的，樣本量依次遞增。故研究中設(shè)計(jì)主要結(jié)局指標(biāo)和次要結(jié)局指標(biāo)很重要。

　　1.4 配對(duì)方法

　　隊(duì)列研究中，可以把無暴露因素（或治療方法）的所有病例作為對(duì)照組，也可在設(shè)計(jì)階段采用配對(duì)方法進(jìn)行對(duì)照組病例選擇，例如進(jìn)行年齡、重要的預(yù)后因素（疾病分期、亞型、并發(fā)癥等）配對(duì)，根據(jù)不同疾病而定，使兩組可比性較好。如果應(yīng)用手工配對(duì)方法，一般配對(duì)的因素為2～4個(gè)，否則很難配到合適的對(duì)照組。如果應(yīng)用一些統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行配對(duì)，如下面案例應(yīng)用的迭代擴(kuò)展半徑法（iterative expanding radius matching），可以適當(dāng)增加配對(duì)因素。配對(duì)的比例一般為1∶1至1∶4，配對(duì)比例達(dá)到1∶4以后，再增加配對(duì)例數(shù)，統(tǒng)計(jì)效能增加不多。

　　案例分析：發(fā)表在N Engl J Med的一項(xiàng)多中心、回顧性隊(duì)列研究題為“應(yīng)用人類白細(xì)胞抗原（HLA）不相合活體供體進(jìn)行腎移植有生存獲益”［3］，該研究目的是探討與單純等待患者或等待后接受死者供體腎移植患者相比，HLA不相合的活體供體腎移植是否有生存獲益。數(shù)據(jù)來源于美國(guó)移植登記數(shù)據(jù)庫，其中有1025例HLA不相合的活體腎移植病例，對(duì)照組采用1∶5配對(duì)，配對(duì)因素為年齡、性別、種族、既往進(jìn)行腎移植的次數(shù)、HLA抗體水平、有無糖尿病、腎臟替代治療時(shí)間7個(gè)因素。配對(duì)方法采用迭代擴(kuò)展半徑法。從單純等待未進(jìn)行腎移植的患者中選擇5125例作為對(duì)照組1，從等待后進(jìn)行了HLA相合死亡供體腎移植中選擇5125例作為對(duì)照組2（表1）。然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析總生存期差異，發(fā)現(xiàn)與等待患者相比，及早應(yīng)用HLA不相合的活體腎供體可提高總生存期。

表1 HLA不相合活體腎移植患者與配對(duì)對(duì)照組的臨床特征比較

　　２ 分析階段需要注意的幾個(gè)問題

　　在統(tǒng)計(jì)分析階段可采用分層分析、多因素分析、傾向性評(píng)分等多種方法校正各種混雜因素，以明確研究因素是否為獨(dú)立危險(xiǎn)因素或預(yù)后因素。

　　2.1 分層分析

　　在分析階段，對(duì)一些最重要的影響結(jié)局、預(yù)后因素進(jìn)行分層分析，目的是觀察消除該影響因素以后，兩組結(jié)局比較是否有變化。例如上文中，對(duì)HLA抗體陽性的不同水平進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)不同抗體水平下，HLA不相合活體供體腎移植仍有生存獲益。

　　案例分析：在一項(xiàng)比較輸血依賴的骨髓增生異常綜合征應(yīng)用去鐵治療和不去鐵治療是否生存期不同的研究中［4］，結(jié)論是去鐵治療可以延長(zhǎng)生存期。因輸血量是疾病嚴(yán)重程度的一個(gè)標(biāo)志，疾病越嚴(yán)重每月輸血量越多，生存期越短。故對(duì)每月輸血量（≤3 U紅細(xì)胞和＞3 U紅細(xì)胞）進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)不同輸血量情況下，去鐵治療均可延長(zhǎng)生存期（圖1），更證明了結(jié)論的可靠性。

圖1 去鐵治療和不去鐵治療對(duì)骨髓增生異常綜合征患者生存期的影響
A.紅細(xì)胞輸注量≤3 U/月; B.紅細(xì)胞輸注量＞3 U/月

　　2.2 多因素分析

　　2.2.1 多因素分析方法

　　因影響結(jié)局的混雜因素較多，多因素分析可同時(shí)校正多個(gè)混雜因素，故其是隊(duì)列研究中常用的統(tǒng)計(jì)方法。常用的多因素分析方法包括多元回歸分析、Logistic回歸分析、COX回歸模型。當(dāng)結(jié)局變量為連續(xù)變量時(shí)，選擇多元回歸分析。當(dāng)結(jié)局變量為分類變量，同時(shí)又要考慮時(shí)間對(duì)該結(jié)局變量的影響（有時(shí)間變量），可選擇COX回歸模型。當(dāng)結(jié)局變量為分類變量，不考慮時(shí)間變量時(shí)，可以選擇Logistic回歸分析。

　　案例分析：在一項(xiàng)“老年貧血患者應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素的治療反應(yīng)和心血管結(jié)局”的回顧性隊(duì)列研究中［5］，應(yīng)用Logistic回歸分析應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素后治療反應(yīng)的影響因素，應(yīng)用COX回歸分析應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素后心血管事件的發(fā)生結(jié)局。治療反應(yīng)統(tǒng)一在治療2個(gè)月后進(jìn)行評(píng)價(jià)，故無需考慮時(shí)間變量。而應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素后心血管事件的發(fā)生需要考慮時(shí)間變量，有的患者使用后很短時(shí)間就發(fā)生了心血管事件，有的患者很久以后才發(fā)生心血管事件。研究結(jié)論是：不論是不進(jìn)行校正的單因素分析［HR=1.21，95% CI: 0.88～1.66, P=0.234］，還是用5個(gè)因素（存在其他血細(xì)胞減少、血紅蛋白水平、年齡、性別、并發(fā)癥指數(shù)）進(jìn)行校正的多因素分析［HR=0.94，95% CI: 0.67～1.31, P=0.693］，均認(rèn)為應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素后并不增加心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。該文根據(jù)不同結(jié)局變量，選擇了2種多因素分析方法。

　　2.2.2 多因素分析變量的選擇

　　選擇多因素分析變量時(shí)主要考慮臨床意義，從文獻(xiàn)或臨床經(jīng)驗(yàn)中確定需要進(jìn)行校正的因素，即可能會(huì)影響結(jié)局的變量。如果樣本量有限，要控制進(jìn)入多因素分析的變量數(shù)量，可先通過單因素分析進(jìn)行初步篩選，然后再納入多因素分析。文獻(xiàn)［4］的研究中，即采用先進(jìn)行單因素分析，把單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素COX回歸分析的方法。而文獻(xiàn)［5］則根據(jù)臨床意義選擇5個(gè)校正變量，未經(jīng)單因素分析篩選，直接進(jìn)行多因素分析。在臨床研究中，可根據(jù)實(shí)際情況選擇其中一種方法，或2種方法聯(lián)用。

　　2.3 傾向性評(píng)分法

　　傾向性評(píng)分法可在分析階段有效平衡非隨機(jī)對(duì)照研究中的混雜偏倚，使研究結(jié)果接近隨機(jī)對(duì)照研究的效果，故有學(xué)者稱其為事后隨機(jī)化法。其通過配對(duì)、分層、回歸等分析方法來校正混雜因素，最常用的是配對(duì)法。與普通配對(duì)法不同的是，傾向性評(píng)分法可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)變量配對(duì)，而普通配對(duì)法的配對(duì)變量是有限的。

　　案例分析：為比較費(fèi)城染色體陽性的急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）應(yīng)用Hyper-CVAD +帕納替尼化療方案與Hyper-CVAD+達(dá)沙替尼化療方案的療效，但兩組基線臨床特征有一定差異，故研究者采用傾向性評(píng)分配對(duì)的方法進(jìn)行了此項(xiàng)研究［6］。首先選擇配對(duì)的8個(gè)因素包括年齡、體能狀態(tài)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、染色體危險(xiǎn)度分組、BCR-ABL1的轉(zhuǎn)錄類型、是否應(yīng)用利妥昔單克隆抗體、CD20陽性的原始細(xì)胞比例、是否有中樞神經(jīng)系統(tǒng)累及。然后應(yīng)用Logistic回歸方法計(jì)算這8個(gè)因素的傾向分值。再應(yīng)用最近鄰居方法對(duì)評(píng)分進(jìn)行1∶1配對(duì)，原有110例ALL病例，經(jīng)過傾向性評(píng)分配對(duì)后，41對(duì)（82例）病例配對(duì)成功。最后，對(duì)這82例病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Hyper-CVAD+帕納替尼化療方案組無事件生存率和總體生存率均優(yōu)于達(dá)沙替尼組。

　　傾向性評(píng)分法能否很好控制混雜因素取決于納入哪些協(xié)變量計(jì)算傾向分值，目前尚無公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，但一般認(rèn)為應(yīng)納入已知的、可能影響結(jié)局的所有混雜因素。

　　2.4 失訪率問題

　　回顧性隊(duì)列研究存在失訪是不可避免的，一般要求失訪率控制在10%之內(nèi)，最多不能超過20%，否則會(huì)存在選擇性偏倚，影響結(jié)果，故應(yīng)盡量控制失訪。如果有較多的病例失訪，可進(jìn)行敏感性分析，把失訪病例的結(jié)局分別按照最差結(jié)局和最好結(jié)局計(jì)算，如結(jié)論無顯著差異，認(rèn)為失訪對(duì)結(jié)論的影響較小，結(jié)論比較可靠。否則，結(jié)論的可靠性較差。

　　３ 撰寫論文規(guī)范

　　隊(duì)列研究屬于觀察性研究，撰寫論文時(shí)要按照觀察性研究報(bào)告規(guī)范（STROBE）來進(jìn)行論文寫作。詳細(xì)的STROBE聲明清單見www.strobe-statement.org網(wǎng)站。在進(jìn)行研究設(shè)計(jì)之前應(yīng)先閱讀該聲明，按照清單上的內(nèi)容進(jìn)行設(shè)計(jì)，才能保證研究質(zhì)量和論文質(zhì)量。

　　４ 小結(jié)

　　臨床醫(yī)生可以利用現(xiàn)有病例資料進(jìn)行各種研究設(shè)計(jì)，根據(jù)不同研究目的選擇不同研究方法，回顧性隊(duì)列研究是常用的設(shè)計(jì)方法。兩組不均衡可比，存在很多混雜因素是回顧性隊(duì)列研究中比較突出的問題，可應(yīng)用上述介紹的各種方法來校正混雜因素，同一研究中可同時(shí)應(yīng)用多種方法進(jìn)行校正。